|
Makmal Sains Sekolah Menengah Kebangsaan Berangan,
Tumpat, Kelantan |
![]() |
PENYEDIAAN SISIP MIKROSKOP
Teknik Menyediakan Sisip Mikroskop
Teknik
menyediakan mikroskop iaitu suatu bidang yang luas. Tujuan
bahan ini bukanlah untuk menghuraikan secara meluas dan
mendalam tentang bidang ini,tetapi hanya memperkenalkan
prisip-prisip asas serta beberapa teknik biasa yang boleh
digunakan oleh guru-guru sains di sekolah.
Penyediaan
sisip kaca mikroskop biasanya melibatkan langkah-langkah yang
berikut :
i)
Penetapan/pengikatan
ii) Membuat keratan
iii) Perwarnaan
iv) Pendehidratan
v) Mencuci
vi) Lekapan
Kesemua enam
langkah tersebut diperlukan untuk penyediaan sisisp kekal,
tetapi bagi peyediaan sisip sementara langkah (i), (iv), dan
(v) boleh di tinggalkan. Sisip-sisip kekal, jika disediakan
dengan baik boleh disimpan selama beberapa tahun. Sebaliknya
sisip sementara hanya boleh digunakan sekejap sahaja, kadang
kala kurang daripada setenjah jam.Walaubaimanapun sisip
sementara lebih kerang disediakan oleh guru-guru biologidi
sekolah kerana lebih menjimatkan banyak masa dan kerja,
berbanding dengan sisip kekal.
(i)
Penetapan/pengikatan
Bahan-bahan biologi yang hendak digunakan untuk menyediakan
sisip mesti direndam dalam sejenis cecair atau larutan untuk
menyelakkan tindakan bakteria atau kulat. Cecair atau larutan
itu dinamakan agen penetap/pengikat manakala proses ini
dipanggil penetapan/pengikatan.
Agen pengikat/penetap yang biasa sekali digunakan untuk
tisu-tisu tumbuhan ialah ‘ Formalasetik-alkohol’ (FAA). FAA
dsediakan dengan mencampurkan lebih kurang 5 cm3 asid asetik
glasial 90 cm3 etanol 70% dan 5 cm3 formaldehid 40%.
Tisu-tisu haiwan boleh direndam dalam fomalin neutral.
Formalin neutral disediakan dengan mencampurkan sedikit
larutan dinatrium tetraborat (boraks) kepada fofmaldehid 40%
sehingga menjadi neutral kepada kertas litmus.
Untuk maklumat lanjut tentang jenis-jenis agen penetap/pengikat
sila rujuk kepada buku-buku lain.
(ii)
Membuat keratan tisu
Tisu-tisu biologi yang hendak diperiksa dengan mikroskop mesti
wujud dalm bentuk keratan nipis yang boleh ditembusi cahaya.
Keratan tisu tumbuh-tumbuhan lebih mudah disediakan kerana ia
lebih keras daripada tisu haiwan.Untuk membuat keratan, tisu
tumbuhan biasanya diapit dengan kepingan polistirene sebelum
dipotong .
Tisu haiwan yang hendak dikerat mestilah terlebih dahulu
direndamkan dalam parafin untuk menjadikannya
keras.Langkah-langkahnya adalah seperti berikut:
1.
Panaskan sedikit pepejal parafin ( suhu lebur lebih kurang
52-56 celsius ) pada suhu 2 atau 3 darjah lebih tinggi
daripada suhu leburnya,dengan kukus air.Masukkan tisu haiwan
yang tersebut ke dalam cecair parafin dan biarkan selama satu
jam pada suhu yang sama.
2.
Ambil sebuah kotak mancis dan sapukan bahagian dalamnya dengan
sedikit gliserol.Tuangkan parafin panas (suhu tidak melebihi
58 darjah celcius ) ke dalam kotak mancis tersebut. Letakkan
tisu haiwan di bahagian tengah cecair parafin.
3.
Pegang kotak mancis itu di atas sebaldi air sejuk dan tiupkan
permukaan parafin lebur itu dengan angin,Apabila cecair
parafin di permukaan membeku, rendamkan seluruh kotak mancis
tersebut ke dalam baldi berisi air sejuk itu. Kesemua parafin
dalam kotak mancis akan membeku. Sekarang tisu haiwan itu
sedia untuk dipotong menjadi kepingan nipis.
Kadangkala
tisu-tisu biologi lebih mudah dipotong dengan menggunakan
sejenis mikroton tangan. Harga mikrotom tangan ini adalah
agak murah dan mampu dibeli oleh semua sekolah. Tisu yang
hendak dipotong itu dimasukkan ke bahagian tentah mikrotom.
Pusingkan skru di bahagian bawah mikrotom itu satu pusingan
kemudian hiriskan tisu yang menonjol ke atas dengan mata pisau
cukur.
(iii)
Pewarnaan
Pewarna untuk
sisip mikroskop boleh dibahagikan kepada dua golongan utama;
i) pewarna bersifat bes, misalnya metilena biru fuksin bes,
hablur ungu, safranin dan sebagainya ii) Pewarna bersifat
asid , misalnya fast green, hijau muda, anilina biru dan
sebagainya.
Pemilihan
pewarna untuk tisu dibuat berdasarkan sifatnya, iaitu bersifat
bes dan asid. Pewarna bersifat bes digunakan untuk mewarnakan
bahagian-bahagian tisu bersifat asid, manakala pewarna
bersifat asid pula digunakan untuk mewarnakan
bahagian-bahagian tisu bersifat bes. Misalnya. Oleh kerana
nukleus sel mempunyai asid nukleik, ia bersifat
asid maka
nukleus biasanya diwarnakan dengan pewarna-pewarna bes
seperti metilena biru atau safranin.
Selain
daripada itu, terdapat juga pewarna-pewarna tertentu yang
hanya boleh dilekatkan kepada tisu jika sesuatu mordan
digunakan bersama. Sebagai contoh, Ferum (III) Ammonium
Sulfat ialah sejenis mordan bagi pewarna hematoksilin dalam
pewarna tisu haiwan.
(iv)
Banyak jenis cecair organik digunakan dalam proses penyediaan
sisip mikroskop. Bahan-bahan organik ini, jika dicampurkan
dengan air, akan menghasilkan seuatu koloid yang menganggu
penglihatan. Oleh itu, sebelum atau selepas proses pewarnaan
(Mengikut keadaan) tisu itu biasanya direndam dalam etanol
untuk membuangkan kandungan aairnya. Proses pembuangan air ini
dinamakan pendehidratan.
Akan tetapi ,
jika keratan tisu direndam terus ke dalam etanol tulen,
terlalu banyak aair diserap keluar, maka sel-sel itu akan
berubah bentuknya atau menjadi rosak. Untuk mengelakkan kesan
ini, keratan tisu biasanya direndamkan dalam etanol mengikut
giliran yang berikut:
1.
Rendamkan dalam etanol 30% selama 1 minit.
2.
Pindahkan ke etanol 50% selama 1 minit;
3.
Pindahkan ke etanol 70% selama 1 minit;
4.
Pindahkan ke etanol 90% selama 2 minit;
5.
Pindahkan ke etanol 95% selama 2 minit.
6.
Pindahkan ke etanol 100% selama 2 minit.
7.
Pindahkan ke etanol 100% yang baru selama 2 minit lagi.
Sekiranya
sebelum pendehidratan keratan tisu itu telah direndam dalam
sejenis pewarna yang menggunakan etanol 70% sebagai
pelarutnya, maka dalam proses pendehidratan yang berikutnya
keratan tisu itu TIDAK perlu direndamkan ke dalam etanol 30% ,
50% dan 70% lagi ianya boleh terus dimasukkan ke dalam etanol
90%, dan selanjutnya ke dalam etanol 95%, 100%, seperti
susunan tersebut di atas.
(V)
Mencuci.
Jika lekapan hendak dibuat dengan menggunakan balsam kanada
maka selepas pendehidratan, etanol dalam keratan tisuitu mesti
dikeluarkan. Ini adalah kerana etanol tidak boleh bercampur
dengan balsam kanada. Proses pembuangan etanol dari keratan
tisu ini dinamakan mencuci. Akan tetapi, jika gliserol dan
bukan balsam kanada yang akan digunakan dalam lekapan, proses
mencuci boleh ditinggalkan kerana etanol boleh bercampur
dengan gliserol.
Untuk mengeluarkan etanol, keratan tisu biasanya dirandamkan
dalam cecair xilem (awas:beracun) selama beberapa ketika.
Tetapi xilem mempunyai satu kelemahan sebagai agen pencuci:
ia membentuk cecair keruh jika terkena air (biasanya akibat
dari mencuci yang kurang sempurna). Minyak cengkih dan minyak
kayu cedar juga boleh digunakan sebagai agen pencuci.
Jika minyak cengkih dan minyak kayu cedar digunakan,
keratan tisu itu mesti direndamkan dalam xilem pula sebelum
lekapan dengan balsam kanada.
Vi)
Lekapan
Selepas mencuci ,keratan tisu itu boleh diletakkan di atas
kepingan kaca kemudian dititiskan dengan sedikit agen pelekap
dan ditutup dengan sisip kaca nipis. Peranan agen pelekap
ialah menyesar keluar semua udara dari keratan tisu serta
memberikanya suatu angka rujuk biasa (refractive index)
yang hampir dengan kaca ,iaitu lebih kurang 1.53.
agen pelekap yang biasa sekali digunakan dalam makmal sekolah
ialah balsam kanada (yang dilarutkan dalam xilem), biasanya
untuk sisip kekal. Akan tetapi, unutk sisip sementara , agen
pelekap yang lebih sesuai ialah gliserol.
Sisip kekal yang siap disediakan mesti dilabelkan dengan
butir-butir berikut:
i)
Nama spesimen dan jenis keratan
( melintang, membujur, dan sebagainya.)
ii) Pewarna yang digunakan
ii) Tarikh disediakan
iv) Nama orang yang menyediakannya.
Teknik-teknik
Mewarnakan Spesimen Biologi
Teknik Pewarnaan Keratan Tisu Tumbuhan
1.
Safranin dan Fast Green
Keratan tisu daun, batang dan akar tumbuh-tumbuhan hijau
seperti pokok keembung, bunga matahari dan sebagainya boleh
diwarnakan dengan cara ini. Bahagian nukleus,lignin dan
kutikel akan menjadi merah, manakala lain-lain bahagian
menjadi hijau atau biru.
Larutkan 1 gram safranin dalam etanol 50% menjadi 100 cm3 .
Rendamkan keratan tisu dalamnya selama 1/2 jam atau lebih.
Keluarkanya dan basuh dengan air suling. Lepas itu rendamkan
dalam campuran asetik-etanol untuk menanggalkan sebahagian
daripada safranin itu. Jangan rendamkan spesimen terlalu lama
kerana ia menyebabkan semua safranin mungkin tanggal/ Campuran
asetik-etanol disediakan dari 1 nm3 asid asetik glasial dan 99
c,3 etanol 70%.
Dehidratkan dalam etanol 90% dan 100%. Rendamkan dalam Fast
green selama 1/2 minit atau lebih. Larutan Fast Green
disediakan daripada 0.5 gram pepejal Fast green, 50cm3,
etanol 100% dan 50 cm3 minyak cengkih. Untuk menanggalkan
sebahagian fast green rendam dalam campuran minyak
cngkih , etanol 100% dan xilen (nisbah 2:1:1) selama 5 minit.
Pindah ke xilen selama beberapa minit. Letak di atas kepingan
kaca dan lekapkan dengan balsam kanada atau gliserol.
2.
Hematoksilin dan safranin
Nukleus dan kloroplas menjadi ungu, lignin menjadi
merah,sitoplasma menjadi ungu muda.
Sediakan larutan hematoksilin seperti berikut: Campurkan 4 g
hematoksilin , 25 cm3 etanol 100% dan 400 cm3 larutan tepu
ferum (III) ammonium sulfat. Biarkan terdedah kepada cahaya
selama empat hari dalam sebuah kelalang yang mulutnya
tersumbat dengankapas.Turas.Tambahkan 100 cm3 gliserol dan
100 cm 3 metanol. Biarkan di tempat cerah selama enam minggu.
Rendamkankeratan tisu dalam larutan hematoksilin selama 3
minit. Basuhkan dengan air. Tanggalkan sebahagian pewarna
dengan asetik-etanol sambil memerhatikannya di bawah mikroskop
(kurang daripada 1 minit). Basuhkan dengan etanol 70%. Rendam
dalam etanol 70%. Rendam dalam etanol 70% yang telah
ditambahkan beberapa titik ammonium hidroksida. Rendam dalam
larutan safranin selama 5 minit Rendam dalam etanol 50% untuk
menanggalkan sebahagian daripada safranin. Bagi sisip
sementara ,pindahkan keratan tisu ke air suling kemudian
lekapkan dalam gliserol. Bagi sisip kekal, dehidratkan dengan
etanol 70%,90%,95% dan akhirnya 100%. Rendam dalam minyak
cengkih untuk membuangkan etanol. Lekapkan dengan balsam kanan.
Teknik Pewarnaan Keratan Tisu Haiwan
1.
Ferum Hematoksilin
Larutkan 3 g ferum (III) ammonium sulfat dalam 100 cm3 air
suling. Rendamkan keratan tisu dalam larutan tersebut selama
1/2 jam lebih. Basuh dengan air suling.
Sediakan larutan hematoksilin dengan 0.5 g hematoksilin, 10
cm3 etanol 100%, dan 90 cm3 air suling. Biarkan beberapa hari.
Rendamkan keratan tisu dalam larutan hematoksilin salama 1/2
jam atau lebih. Pindahkan ke larutan ferum (III) ammonium
sulfat untuk menanggalkan sebahgian hematoksilin. Basuhkan
dengan air paip selama beberapa jam.
Rendam dalam etanol 30%,50%,70%,90%,95%,100%. Pindah ke xilen
untuk menanggalkan etanol. Lekapkan dalam balsam kanada.
2.
Pewarna Mallory Tiga Peringkat
Mula-mula sediakan tiga jenis larutan yang berikut:
a) 0.1 g asid fuksin dalam 99 cm3 air suling
b) 0.1 g asid fosfomolobdik dalam 99 cm3 air suling
c) 0.5 g anilina biru, 2 g oren G dan 2 g asid
oksalik dalam 99 cm air suling.
Rendamkan keratan tisu dalam larutan
(A) selama 3 minit. Basuhkan dengan air suling.Basuhkan dengan
larutan (B) selama 1 minit supaya warna merah tadi kekal.
Basuh lagi dengan air suling. Sekarang rendamkan dalam larutan
(c) selama 5 minit supaya ia menjadi biru. Basuhkan dengan air
suling. Dehidratkan dengan etanol 30%,50%,70%,90%,95%,100%.
Basuhkan dengan xilen untuk menanggalkan etanol Lekap dengan
DPX.
Teknik Mewarnakan Tisu yang Mengandungi Lemak (Sudan IV)
Rendamkan keratan tisu dalam formaldehid 40% selama 1 minit.
Basuhkan dengan etanol 50%. Rendamkan dalam larutan Sudan IV
selama 2 hingga 3 minit. Larutan Sudan IV disediakan dengan
melarutkan 5 gram pepejal Sudan IV dalam 100 cm3 etanol 70%.
Basuhkan dengan etanol 50%. Lekapkan dalam gliserol.
Bintilan-bintilan lemak akan diwarnakan menjadi merah.
Teknik Mewarnakan Tisu Kulat (Lactophenol-cotton blue)
Tisu
kulat seperti Mucor dan Rhizopus boleh
diwarnakan dengan Lactophenol-cotton blue .
Lactophenol-cotton blue disediakan daripada bahan-bahan
berikut:
hablur fenol 20 g
asid laktik 20 g
gliserol 40 g
cotton blue
(metil
blue) 0.05 g
air suling 20 cm
Rendamkan tisu kulat dalam Lactophel-cotton blue selama
beberapa minit. Basuhkan dengan air untuk menanggalkan
pewarna yang berlebihan . Periksa dengan mikroskop.
Teknik Mewarnakan Sel-Sel Darah (Pewarna Leishman)
Mula-mula sediakan lapisan nipis darah seperti berikut:
Titiskan setitik darah di satu hujung sisip yang bersih.
Dengan segera letakkan sekeping lagi sisip bersendeng 45o
kepada sisip pertama, seperti dalam Rajah (46), dan
TOLOK KE DEPAN. Suatu lapisan darah yang nipis akan terbentuk.
Keringkan
lapisan darah ini SEGERA dengan angin atau dengan
mengeraK-GERAKKAN DALAM UDARA, jika dikeringkan dengan
perlahan, sel-sel darah akan berubah bentuknya.
Sediakan
pewarna Leishman dengan langkah-langkah berikut:
i)
Pastikan semua radas yang digunakan adalah bersih dan kering
betul.
Ii)
Hancurkan 0.2 gram serbuk pewarna Leishman dalam beberapa cm3
metanol 100% dalam sebuah lesung. Tambahkan metanol sedikit
demi sedikit sehingga menjadi 100cm3. Teruskan proses
menghancurkannya selama 20 hingga 30 minit , supaya pewarna
itu betul-betull larut dalam metanol.
iii)
turaskan . simpan dalam botol yang tertutup rapi pada 37% C.
Sediakan
fosfat tampan pH 6.8 dengan keadah berikut:
i)
Larutkan 9.1 gram kaliam dihidrogen fosfat menjadi 1 dm3.
ii)
larutkan 9.5 gram dinatrium hidrogen fosfat menjadi 1 dm3.
iii)
campurkan 50.8 cm3 larutan (i) dengan 49.2 cm3 larutan (ii).
Rendamkan
lapisan darah tersebut dengan pewarna Leishman selama satu
hingga satu setengah minit. Tambahkan sama banyak fosfat
tampan pH 6.8. Tiupkan dengan mulut supaya pewarna bergaul
dengan larutan tampan. Biarkan 10 minit.
Basuh dengan
aliran air yang perlahan. Rendam dalam larutan tampan selama
30 saat atau lebih, mengikut keadaan. Keluarkan sisip dan
biarkan kering dalam udara.
Periksa
dengan mikroskop. Nukleus sel darah putih akan diwarnakan
menjadi biru.
Teknik
Mewarna Bakteria (Pewarna Gram)
Mula-mula
sediakan larutan-larutan yang berikut:
i),
Larutan hablur Ungu (atau metil ungu)
hablur ungu
- 2.5 gram.
Air suling
- 500 cm3
ii).
Larutan Iodin
iodin
- 5.0 gram
Kalium iodida
- 10.5 gram
air suling
- 500 cm3
iii)
Larutan Safranin (atau neutral red)
Safranin
- 5.0 gram
air suling
- 500 cm3
atau
Neutral
red - 0.5 gram
asid asetik
1% - 1.0 cm3
air suling
- 500 cm3
Sapukan
bakteria di permukaan sisip supaya membentuk satu lapisan
nipis.
Panaskan
dengan api selama 2-3 saat supaya bakteria terlekat pada
permukaan sisip. Biarkan sejuk.
Rendamkan
bakteria dengan larutan hablur ungu atau metil ungu selama 1/2
- 1 minit. Jangan basuh dengan air selepas ini.
Tambahkan
larutan iodin dan biarkan 1/2 - 1 minit. Sekarang basuhkan
nya dengan sedikit aseton . jangan basuh terlalu lama.
Basuh pula
dengan air. Rendam dalam safranin atau neutral red selama 2
minit atau kurang. Basuh sekali lagi untuk membuang safranin
yang berrlebihan dengan air. Biarkan kering dalam udara.
Periksa Bakteria Gram (+) akan menjadi biru-ungu, manakala
bakteria Gram (-) akan menjadi merah.
Teknik
Mewarna Kromosom (Kaedah aseton orscein)
Tisu yang
sedang mengalami proses mitosis atau meiosis. Seperti hujung
akar bawang atau buah zakar belalang (Valanga), boleh
diwarnakan dengan kaedah ini.
Mula-mula
sediakan larutan aseto-arsein seperti berikut: tambahkan 2
gram orcein kepada campuran 45 cm3 asid asetik glasial dan 55
cm3 air suling. Masukkannya ke dalam sebuah kelalang 250 cm3
dan pasangkan pemeluap Liebeg dalam keadaan tegak. Didihkan
selama 30 minit. Biarkan sejuk. Turaskan , hasil turasannya
berwarna ungu tua. Simpan dalam peti sejuk.
Jika hujung
akar bawang digunakan ia mesti direndamkan dalam
asetik-alkohol selama 24 jam terlebih dahulu, kemudian
dipindahkan ke dalam asid hidroklorik 1 molar pada 60 C selama
5 minit.
Letakkan tisu
itu di atas sisip kaca. Tambahkan beberapa titik aseto-arsein
dan koyakkannya menjadi hancur dengan dua batang jarum.
Tutupkan dengan penutup kaca nipis . Panaskan sisip kaca
dengan api atau plat panas selama 5 minit, tetapi jangan
biarkannya mendidih, tambahkan aseto-orsein lagi jika ia
tersejat.
Sekarang
tutupkan sisip itu dengan beberapa lapisan kertas tisu dan
tekankannya DARI ATAS dengan ibu jari ( Jangan biarkannya
gelansar ke TEPI) supaya sel-sel akar terpisah antara satu
sama lain. JANGAN TEKAN TERLALU KUAT. Ascto-orsein yang
berlebihan akan diserap oleh kertas tisu.
Hangatkan
sisip di atas plat selama 10 saat lagi, supaya warna
aseto-orsein menjadi lebih merah. Periksa dengan mikroskop.
Semua kromosom akan menjadi warna merah.
| 
